Nace en Florencia, en 1856. Su padres eran ambos estadounidenses. Su padre era un médico de éxito, y su madre, hija de un próspero comerciante. Los padres de John Singer Sargent se habían instalado en Europa de forma permanente aunque con frecuentes cambios de residencia.

Sargent recibe sus primeras lecciones de pintura con Carl Welsch, un paisajista germano-estadounidense. En 1873 se matricula en la Accademia delle Belle Arti de Florencia. Poco después, su familia se traslada a París y Sargent empieza a acudir al estudio de Carolus-Duran, donde se pondrá en contacto con los impresionistas, interesándose especialmente por Manet. Sus deseos de establecerse como retratista en París se ven truncados por el escándalo que provoca su retrato de Virginie Gautreau -conocido como "Madame X"- en el Salón.

En 1879, Sargent viaja por España, donde realiza frecuentes visitas al Museo Nacional del Prado de Madrid y copia varias obras de Diego Velázquez, un artista que siempre estará en su punto de mira, junto a otros maestros del pasado como Francisco de Goya y Frans Hals.

En 1885-1886, Sargent se instala en la colonia de artistas y escritores ingleses de Broadway (Worcestershire, Inglaterra), convirtiéndose en poco tiempo en el retratista más mimado de la alta sociedad británica y norteamericana: magnates como Rockefeller o Vanderbilt, presidentes como Theodore Roosevelt, intelectuales como Robert Louis Stevenson o Henry James... las personalidades más celebres del momento quedan inmortalizadas por el artista, que rechazó la oferta de pintar el retrato de coronación del rey Eduardo VII.

En 1890 le encargan la decoración mural de la Boston Public Library, que no quedó definitivamente instalada hasta el año 1916. Nueve años antes, el gobierno británico le propuso otorgarle el título de Sir, un honor que Sargent no pudo aceptar debido a su nacionalidad norteamericana.

Entre 1903 y 1912 recorrió España, Italia y Francia, y en 1905 visitó Siria y Palestina. Al estallar la guerra de 1914 acude al frente en Francia en calidad de artista de guerra oficial. En esos años el Metropolitan Museum of Art adquiere la polémica "Madame X", y Sargent rechaza la presidencia de la Royal Academy.

En 1919 vuelve a Boston para realizar la decoración del Museum of Fine Arts. Cinco años más tarde se celebra una gran exposición de sus obras en las Grand Central Art Galleries (Nueva York). Sargent murió mientras dormía el 15 de abril de 1925, en Londres. El 24 de abril se celebró su funeral en la Abadía de Westminster.