El retablo, fechado entre los años 1475 y 1480, es una joya de la pintura gótica extremeña y una obra maestra en sus tableros de pincel. Tiene una clara atribución al pintor salmantino Fernando Gallego y su taller, pero mantiene aún la dificultad de precisar cuántas manos intervinieron en su ejecución. Las tablas, de gran calidad y estilo hispano-flamenco, recogen varios episodios de la vida de Cristo y de la Virgen.

La obra, de gran tamaño, se asienta sobre un sotabanco de granito de reciente factura, cuya traza se adapta al ábside poligonal de la cabecera de la iglesia. Su estructura arquitectónica se articula en banco, tres cuerpos y siete calles, formando una retícula donde se distribuyen las 25 pinturas sobre tabla.

La calle central, más ancha que las otras, queda libre de tablas hasta la altura del tercer cuerpo para albergar el sagrario expositor y una talla del XIX, obra del valenciano Modesto Pastor, que representa a la Virgen de la Asunción. Esta última pieza sustituyó a una de las tablas, que actualmente está en la sacristía del templo.

La actual disposición del retablo no es la original ya que ha sufrido diferentes intervenciones en sus más de 500 años de historia, siendo la más importante la realizada en el siglo XVIII con la incorporación del camarín, que debió obligar a desmontarlo. No se conserva en contrato del retablo y el libro de fábrica de la iglesia solo recoge algunos pagos de intervenciones posteriores a su ejecución.

Consta que ha sido limpiado, redorado y retocadas sus pinturas en numerosas ocasiones, la primera en 1560, y la última en 1985. En 2005 fue restaurado por técnicos del IPHE, quienes realizaron una intervención arquitectónica para subsanar los problemas de conservación preventiva; hicieron análisis y estudios químicos, físicos e históricos, y restauraron siguiendo los criterios actuales de realización de la mínima intervención.

El retablo de la Iglesia de Santa María la Mayor de Trujillo posee una sencilla mazonería que enmarca sus tablas, con finas pilastras y arcos conopiales en forma de aplanados doseles, adornados con tracerías caladas, floroncillos de cardinas, frisos tallados y delgadas columnas laterales retorcidas, todo ello restos del trabajo original característico de las postrimerías del gótico florido. Los fondos de la tracería dejan ver un temple azul, al estilo de la escuela castellana, repolicromado en rojo como su crestería de rocalla dieciochesca.