Fue el Cardenal Cisneros quien acometió la gran transformación del presbiterio. El antiguo retablo se alzaba entre los pilares del Pastor de las Navas y el de Alfaquí, justo donde terminan los peldaños de la escalinata; detrás estaba la Capilla de la Santa Cruz, fundada por Sancho IV como panteón real. Al elevar el plano para el Altar Mayor, debajo quedó una cripta: la capilla subterránea del Santo Sepulcro, por haber labrado un grupo escultórico con ese tema Diego Copín de Holanda, y donde se guarda el cuerpo momificado de Santa Úrsula.

Para dar cima a la prodigiosa empresa del nuevo retablo mayor, dirigida por Petit-Jean, una pléyade de imagineros con sus equipos labraron, en madera de alerce de los pinares de Ávila, los quince grandes grupos escultóricos, sin contar la bancada, interviniendo Rodrigo Alemán, Sebastián Almonacid, Felipe Bigarny, Diego Copín... Otros especialistas, Juan Borgoña y Francisco de Amberes, recubrieron todo de oro fino, para luego policromarlo. El diseño pertenece a Enrique Egas y Pedro Gumiel. Se tardó seis años en finalizarlo (1498-1504).

Es un impresionante mundo de calados doseletes, pináculos y filigranas, articulado a través de siete calles y cuajado de multitud de figuras. La calle central comienza en la pedrela, con la efigie de Santa María, del siglo XIV, chapada en plata y procedente del antiguo retablo; sigue la enorme custodia -inspiración para el platero Enrique de Arfe, y, como detrás está la habitación del sagrario, 200 años después, para iluminarlo, se haría el Transparente-, continuando con la Natividad y la Asunción, y coronándose el conjunto con un enorme Calvario.