A pesar de la perplejidad de algunos historiadores, parece ya aceptado que este óleo sobre lienzo de gran tamaño (275 x 127 cm) formó parte del retablo del colegio agustino de Nuestra Señora de la Encarnación de Madrid -llamado de doña María de Aragón por la donante del colegio-, donde estaba colocado en el extremo derecho del registro superior, encima del Bautismo de Cristo y a la derecha de la Crucifixión. Actualmente se conserva en el Museo del Prado tras ser desmontado el conjunto durante la ocupación francesa.

El encargo para dicho retablo madrileño -que el artista cretense deba probablemente al albacea de la noble, ya que doña María de Córdoba y Aragón falleció unos tres años antes de empezar las obras- fue el más importante que recibió El Greco y le retribuyó la importante cantidad de 6.000 ducados.

Los Hechos de los Apóstoles cuentan que, en una reunión celebrada en Jerusalén diez días después de la Ascensión, coincidiendo con la fiesta hebrea de la Pentecostés (cincuenta días después de Pascua), reunión en la que tomaban parte la Virgen y los doce apóstoles, la habitación fue atravesada, con un gran fragor de trueno, por un viento ígneo, y sobre las cabezas de los presentes descendieron lenguas de fuego. El Espíritu Santo, que descendió sobre los apóstoles, les habría dado la facultad de expresarse en todas las lenguas del mundo, hecho después verificado con los peregrinos extranjeros que estaban en la ciudad.

El Greco representa el tema, frecuente en la época de la Contrarreforma, con la Virgen sentada y absorta en la oración, vestida de rojo con manto azul y la mirada vuelta al cielo, donde se ve la paloma del Espíritu Santo rodeada de una serie de personajes no bien identificados, entre los cuales se distingue quizá a San Pedro, con túnica amarilla, una mujer (detalle curioso, identificada cada vez más firmemente con Santa María Magdalena) y un maduro rostro con barba blanca que mira hacia el espectador, considerado generalmente como un autorretrato del pintor. Dos figuras en primer plano, de espaldas, destacan por su volumen. Sobre todos descienden, sorprendiéndolos, las lenguas de fuego.

También en este caso, El Greco estira la escena en vertical, creada por los relámpagos de luz y los vivaces gestos con que los personajes muestran sus diversas impresiones. El artista pasa por un periodo en el que aumenta la movilidad de las figuras y el dramatismo de la luz, hasta el punto de que, no sin razón, se ha hablado de un estilo "expresionista" al referirse a esta época. Tanto Pentecostés como la Anunciación, la obra principal del retablo (imagen inferior), documentan perfectamente la osada elección del colorido, típica de toda la serie. En la Anunciación, además, El Greco parece haber abandonado toda relación con el mundo objetivo.

La obra Pentecostés se halla firmada en caracteres griegos minúsculos: DOMENIKOS THEOTOKOPOULOS EPOIEI. El asunto, no frecuente en el repertorio sacro de El Greco, es mencionado en el inventario que hizo Jorge Manuel en 1621 en un par de casos que no coinciden con éste, pintado entre los años 1596-1600. El lienzo ha sido apreciado por la crítica por sus extraordinarios juegos luminosos. Existe una réplica (104 x 52 cm) en la colección de la condesa de Zogheb, en Monfort l'Amaury (Seine-et-Oise), quizá de escuela o de su hijo.